PN-III-P1-1.1-PD-2016-2137
Contract 113/2018
Mapping the insertion sites of some transposons involved in antibiotic resistance Acronim: MIST-AR
Antibiotic resistance (AR) is major health issue worldwide. The understanding of genetic background of AR is a key strategy in order to slow the spread of high-risk multidrug-resistant clones. While many studies are focused on describing the encoding genes of antibiotic-degrading enzymes, still the non-enzymatic genetic background of resistance is poorly studied.
Mobile genetic elements (MGE) plays a major role in dissemination of AR encoding genes (ARG). Bacterial simplest MGEs are represented by insertion sequences (ISs) and transposons, which may carry in their structure ARG. As they may transpose (travel) within or between bacterial genomes, they have a major contribution in spreading of AR.
Moreover, even this MGEs don't carry an ARG, they can be involved in AR by inserting within certain genes or in their regulatory regions, thus inactivating/activating/up-regulating certain genes encoding for drug intake, efflux pumps, or activators/inhibitors of some metabolic pathways, which ends up in AR, possibly in multidrug-resistance phenotype.
We propose here a unique strategy to precisely determine the insertion sites of some transposons involved in AR at whole-genome level, by optimizing an inverse-PCR protocol targeted for bacterial ISs. As we will use clinical strains of Klebsiella pneumoniae (Gram negative enterobacteria), we expect to describe the genetic background of resistance determined by transposons for high-risk epidemic clones, and thus to contribute (at international level) to the understanding of resistance spreading in such clones. Also, this work will be materialized in a molecular kit for mapping the insertion sites of AR determining transposons, as a ready-to-use methods for researchers everywhere.
Objective
The purpose of this study is mapping the insertion sequence of some transposons involved in antibiotic resistance, by combining microbiological, molecular biology and bioinformatics tools, in order to select high-risk clones and favoring genetic context for the persistence, dissemination and transfer of resistance genes.
Expected results
Our project will provide a powerful yet simple methodology (compared to the NGS technique) in order to investigate the transposons, but also to enlighten the molecular basis of antibiotic resistance (other mechanisms than enzymatic involved in antibiotic resistance), both of which (to our best knowledge) being never investigated before in Romania. The results of the proposed project will contribute to the local and international knowledge of antibiotic resistance, as Romania, amongst other eastern European and Balkan countries, is considered an important reservoir of antibiotic resistance. Thus, our data will unveil the non-enzymatic antibiotic resistance phenomenon, by describing the potential high-risk K. pneumoniae clones by means of transposon insertions within key genomic regions.
Cartarea inserțiilor unor transpozoni asociați cu fenomenul de antibiorezistență
Rezistența la antibiotice (RA) reprezintă o problemă de sănătate la nivel global. Înțelegerea suportului genetic al RA este una din strategiile de bază care vor conduce, în cele din urmă, la încetinirea răspândirii clonelor bacteriene de risc, cu rezistență multiplă la antibiotice. Numeroase studii vizează descrierea genelor codificatoare de enzime care degradează molecula de antibiotic, însă mecanismele neenzimatice sunt încă puțin studiate.
Elementele genetice mobile (EGM) au un rol important în răspândirea genelor codificatoare ale RA (GRA). Cele mai simple EGM sunt reprezentate de secvențele de inserție (SI) și transpozoni, care pot dobândi în structura lor GRA. Deoarece au capacitatea de a se transpoza (mobiliza) in interiorul unui genom sau între genomuri bacteriene, au o contribuție majoră în răspândirea RA. În plus, chiar dacă un EGM nu are în structura sa GRA, poate fi implicat în apariția unor fenotipuri de RA și chiar rezistență multiplă, prin inserarea în anumite gene sau în regiuni reglatoare ale acestora, astfel activând/inactivând/determinând rate înalte ale transcrierii pentru anumite gene codificatoare pentru influxul antibioticului în celulă, pompe de eflux sau activatori/inhibitori ale unor căi metabolice.
Propunerea noastră constă în elaborarea unei strategii unice pentru determinarea cu precizie a situsurilor de inserție ale unor transpozoni implicați în RA la nivel genomic, prin optimizarea unui protocol de inverse-PCR țintit pentru IS bacteriene. Vom utiliza tulpini clinice de Klebsiella pneumoniae (bacil Gram negativ enteric), astfel încât ne așteptăm să descriem substratul genetic al RA determinat de transpozoni la clone epidemice de risc înalt, și astfel, contribuind la nivel internațional, la înțelegerea răspândirii RA în astfel de clone. De asemenea, rezultatele vor fi materializate într-un kit molecular pentru cartarea situsurilor de inserție ale transpozonilor ce determină RA, ca metodă implementabilă în laboratoare de pretutindeni.
Obiectiv
Scopul acestui proiect este reprezentat de cartarea inserțiilor unor transpozoni asociați cu fenomenul de antibiorezistență, reunind metode de microbiologie, biologie moleculară și bioinformatică, pentru a putea selecta clonele bacteriene cu risc înalt și contextul genetic favorizant persistenței, diseminării și transferului de gene de antibiorezistență.
Rezultate estimate
Implementarea unei metodologii cu rezoluție înaltă, dar simplă (comparativ cu tehnica NGS) pentru investigarea transpozonilor, dar și determinarea suportului molecular al rezistenței la antibiotice (inclusiv alte mecanisme decât cele enzimatice), cele două aspecte nemaifiind investigate anterior în România (după cunoștințele noastre).
Rezultatele vor contribui la cunoașterea pe plan local, dar și internațional a rezistenței la anibiotice, având în vedere că România, printre alte țări est-europene și balcanice, este considerată un rezervor al rezistenței la antibiotice. Astfel, rezultatele așteptate vor elucida fenomenul de rezistență de tip neenzimatic, prin descrierea potențialelor clone cu risc înalt de K. pneumoniae prin prisma inserțiilor unor transpozoni în regiuni genomice cheie.